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讲解一下荧光定量PCR仪选择要点及误区

发布时间: 2021-06-18  点击次数: 51次
  荧光定量PCR 因操作方便、运行速度快、实验结果准确,受到越来越多的分子生物学研究者青睐。在实验技术成熟的今天,也许对你来说,难的不是实验技术上的问题——而是选择哪一种荧光定量PCR仪,面对各种不同性能的产品,您又该如何选择呢?
  今天为您讲解一下荧光定量PCR仪选择要点及误区
  先建议大家走出认识荧光定量PCR的两个误区:
  误区一:仪器通道越多越好
  随着PCR技术的成熟运用,多重扩增越来越热闹,荧光定量PCR仪也不能幸免。从zui初ABI公司推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪,眼花缭乱的选择让人无所适从,就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。
  在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料)或专用的Reference dye ,这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要,不能单单只听宣传。
  考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发,多重PCR并非人人适用、人人可用,因为它使实验复杂化了。
  误区二:real-time PCR仪无需梯度功能
  对于使用染料法的定量PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出适合的反应条件。

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