荧光定量pcr原理和步骤

荧光定量pcr是一种新兴的pcr技术，它通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，也被称为实时荧光定量pcr。

一、荧光定量pcr特点和优势

1、传统定量PCR方法

a、竞争法

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

b、内参照法

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，Z终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

2、荧光定量pcr vs 传统定量PCR

荧光定量pcr是从传统基于凝胶的低通量PCR技术发展而来的高通量的荧光分析技术，是一种实时定量PCR方法。

实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

二、荧光定量pcr的两种方法类型

荧光定量pcr常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）

1、荧光染料掺入法

荧光染料掺入法原理是：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。

此方法适用：

a、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。 

b、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上 

d、专一性要求不高的定量PCR检测。 

e、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。

f、高通量大规模的定量PCR检测 

2、探针法

探针法荧光定量pcr原理是：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步 

此方法适用：

a、适用于扩增序列专一的体系的检测。 

b、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。 

c、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。 

d、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。 

e、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。 

f、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。

三、实时荧光定量PCR技术的应用

荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的。经过二十年的发展，该技术已经被广泛应用于临床疾病诊断各型肝炎、艾滋病、禽 LIU感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；临床疾病诊断、禽LIU感、新城疫、口蹄疫、猪瘟等动物疾病检测；食源微生物、食品过敏源、转基因研究等食品安全操作。等等各个领域。

1、基因分型

例如SNP检测，甲基化检测等。

SNP检测是确定一对染色体的每种基因的两个拷贝，哪种点突变在这两个拷贝中存在，因此利用荧光定量PCR方法，并配合芯片技术可以快速灵敏的检测到SNP结果。

DNA甲基化是Z早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

2、基因表达差异分析

例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证 。

基因表达差异通常是指一个基因在两个条件中表达水平的检测值在排除实验、检测等因素外，达到一定的差异，具有统计学意义，同时也具有生物学意义。

3、DNA 或RNA 的定量分析

包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。基因失活是指利用反义技术，使非正常基因或有害基因不表达或降低表达活性，以达到治疗某些特定疾病的目的。