热盖

ABI7500热盖简介：
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ABI7500热盖应用：
一. 开 机
1. 确认电脑与主机的数据通讯线(灰色USB连线)连接正确。
2. 确认电脑处于外接电源供电状态。
3. 启动电脑，以Administrator用户名登录，进入Windows2000操作系统。
4. 待桌面图标出现后，打开7000主机的电源。
5. 待主机的电源指示灯点亮后，启动7000 SDS应用软件。
在进行实验之前，请先检查样品加热模块以确定它没有受到荧光污染，具体方法请按照第6节的“荧光污染的检查与处理”流程进行。
二. 实时定量的软件运行
基因表达的绝对定量和相对定量研究、转基因食品的检测(GMO)、各种病原体的检验检疫等各种定量应用；以CT值的大小作为样品阴性、阳性判定依据的定性应用；以及SNP检测、等位基因鉴定实验等的第一步PCR扩增，都是采用实时定量模式，按照以下步骤操作。
1. 新建文件 菜单File → New，Assay选择Absolute Quantification (实时定量模式)，打开一个空白的96孔板文件。

2. 探针设置 双击任意一个孔，打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。
3. 使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File → New，新建探针：设定探针的名称(建议使用所研究基因符号，如GAPDH、ACTIN等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None)、颜色等。设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。重复此过程，设立其他的探针。
4. 在Detector Manager窗口，从探针列表中点击选择所需探针，按住Ctrl键可以选择多个探针，再点击Add to Plate Document按钮。最后点击Done关闭Detector Manager窗口。此时Well Inspector窗口仍然是打开的。
5. 填样品表 在96孔表中选定有样品的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品名称；在探针列表的Use项下的方框中，打钩选择要用的一个或多个探针；在Task栏中选择样品类领：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown；标准品选Standard。对于Standard，还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注 意：只有在这里输入拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上。建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。
6. 参比荧光 如果使用的是ABI公司的定量PCR试剂，如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR Master Mix等，参比荧光(Passive Reference)选ROX；如果使用的试剂中不含有参比荧光，请选None。完成后点击右上角的X按钮，关闭Well Inspector窗口。
7. 循环参数 切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序：在ABI公司默认的程序中，50 C°C 2 C 15°min是UNG酶起作用的步骤，UNG酶可以预防其他PCR扩增的产物(其中以U代替T)对定量PCR的污染；95 C 1°10 min是定量PCR的循环步骤。7000默认在最后一步，也就是60°min的作用是激活金牌Taq酶，同时灭活UNG酶；40个循环的95 C 1°sec和60 min复性和延伸时收集荧光信号。如果使用ABI公司的定量PCR试剂，上述参数不需要调整，直接运行PCR循环就可以了。在使用其他厂家试剂的情况下，如果其中没有UNG酶，请删除50°C 2 min步骤；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，请删除95°C 10 min步骤。
8. 循环参数的修改方法 删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击，该步骤被选中变黑，按Del键即可删该步骤或循环。插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标，选中需要修改的温度或时间数字，输入新的数值即可。
9. 其他设置 反应体积：定量PCR的标准反应体积是50 μL；如果想修改的话，建议大于25 μL。融解曲线试验：在Dissociation Protocol选项左边的方框中打钩，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBR Green I染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。注 意：只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。9600 Emulation：选中此项，即可使7000的升降温速度减慢，与9600和7700一样，从而可以直接使用在9600、7700型PCR仪上优化好的循环条件，而不需任何修改。
10. 启动扩增 点Save按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后，点击Start按钮，开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。
11. 监控进程 切换到Results页面的Amp Plot子页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC，只显示对应探针的变化情况；如果选All，则同时显示所有探针的反应进程。
12. 保存结果 程序结束后，点Disconnect按钮，然后File → Save保存实验结果。可以保存为.sds格式，也可以保存为.sdt格式，作为以后同类实验的模板，节省软件设置时间。
三. 实时定量的数据分析
1. 数据分析 切换到Result页面，进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面，查看软件已经自动分析好的实验结果。注 意：此时的数据是软件根据默认值（基线起点为3，终点为15）得到的初步结果，还需要根据本次实验的具体情况，精细调节Baseline（基线）的起止点后，重新分析，以得到更精确的数据。
2. 基线的起点和终点确定原则 基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，一般在3到6个循环之间；终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方，一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。另外，起点与终点之间最好能间隔8个循环以上，以满足统计基线标准偏差的数学要求。调整好起止点以后，再点击Analyze按钮，软件即自动计算新的阈值和CT值，并更新实验报告。注 意：此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新，但是这不影响后台数据运算的准确。
3. 线性图谱 在默认的设置中，PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度，横坐标代表PCR循环次数（从1到40）；纵坐标以对数表示，横坐标以线性表示。如果要看*线性的S形图谱，请双击纵坐标轴线，打开坐标设置窗口，将纵坐标改成线性形式。
4. 原始数据 切换到Component子页面，察看原始数据。正常的FAM信号强度，基线时约为5000点，扩增完成达到约28000点，中间呈S形增长；TAMRA和ROX的信号开始时都比FAM的基线要稍低一点，TAMRA信号到指数增长阶段会降低，而ROX信号是水平稳定的，不随PCR进程而改变，因为ROX是以固定浓度加入到PCR试剂中的，它本身并不参与PCR扩增。
5. 原始数据 切换到Spectra子页面，也可以察看原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是：Component显示的是信号强度随时间(即PCR循环次数)的变化，是纵向的；而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布，也就是在4个滤色片上的分布，是横向的。
6. 标准曲线 切换到Standard Curve子页面，察看标准曲线。注 意：只有在Set up时输入标准品的拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。
7. 实验报告 切换到Report子页面，察看实验报告。确认无误后，保存结果。也可以从File菜单中选择Export，再选择数据类型，输出各种类型的数据，包括CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开，并可在Excel中重新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。
四. 终点读板的软件运行
各种等位基因鉴定实验，包括SNP检测、基因突变检测等，都包括两个阶段：1、PCR扩增；2、扩增后的荧光信号读取（Post-read）和数据处理。第一步既可以在9700、9600等普通的PCR仪上进行，也可以在7000、7900等定量PCR仪上进行；第二步必须在定量PCR仪上进行。以下只叙述第二步Post-Read和数据处理的操作方法。如果第一步也在定量PCR仪上进行，请按第三节实时定量的实验方法设置和运行软件；待PCR完成、数据保存好后，再将同一块板放在7000上，按以下步骤操作。
1. 新建文件 菜单File → New，Assay选择Allelic Discrimination (终点读板模式，用于SNP分析等)，新建一个空白96孔板文件。
2. 探针设置 双击任意一个孔，打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。
3. 使用软件，或者Marker没有设置好，先点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，File → New，新建探针，设定探针的名称(建议使用等位基因的名称，如Allele 1、Allele 2等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None)、颜色(任意)等。设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。
4. 位点设置 Detector设置好后，点击Add Marker按钮，打开Marker Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Marker Manager打开。如果在Marker列表中找不到合适的探针，点Create Marker，取名(建议使用位点的名称，如D2S1356等)，OK，新位点的名字即出现在左边的位点列表中，选中位点，在右边的探针列表中打钩选择与该位点配套的探针，一般FAM、VIC各一个组成一套。
5. 选择位点 Marker设置完成后，在左边的位点列表中选中该Marker，点击Copy to Plate Document按钮，该Marker的信息即分成3行出现在Well Inspector窗口中。重复选好全部所需Marker，再点击Done关闭Marker Manager窗口。注 意：定量PCR实验只要求设置探针(Detector)即可，而SNP实验既要设置探针(Detector)，还要设置位点(Marker)。如果没有设置Marker，软件将不能进行基因分型。
6. 填样品表 在96孔表中选定有同类样品的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Marker列表的Use项下的方框中打钩，选择要用的Marker，然后在探针的Task栏选择样品类型：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown。没有Std。
7. 参比荧光 如果用的是ABI公司的PCR试剂，如TaqMan Universal PCR Master Mix with or without UNG，参比荧光(Passive Reference)选ROX；如果所用试剂中不含ROX参比荧光，请选None。
点击右上角的X按钮关闭Well Inspector窗口。
8. 循环参数 切换到Instrument页面。PCR热循环程序只有60°C一个步骤，不需要修改。设置反应体积。SNP的标准反应体积是50 μL。点Save按钮保存文件设置。
9. 终点读板 确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后，点击Post-read按钮，开始读取数据，大约10秒完成。
10. 保存结果 程序结束后点Disconnect按钮，然后File → Save保存实验结果。
五. 终点读板的数据分析
1. 数据分析 切换到Results页面，Allelic discrimination子页面，在Marker下拉菜单中选择要查看其数据的Marker，在下面96孔板界面中按Excel方式选择需要查看的样品孔，软件即在中间的图谱上显示信号的分布情况。选择不同的Marker，显示不同的信号。可以点击放大或缩小工具调整图谱的大小。
2. 信号分布 正常的信号应该分为4组，靠近原点处为NTC；靠近X轴的是VIC信号，是纯合子，其正常信号强度范围在2-8之间；靠近Y轴的是FAM信号，是另一种纯合子，其正常信号强度范围在4-16之间；靠近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号，是杂合子，强度为FAM和VIC各自的一半左右。
3. 基因分型 点击套索工具，然后通过鼠标圈定NTC信号，在Call下拉菜单中选NTC，这些数据点即被分型为NTC并显示相应的颜色和图标；同样分型FAM纯合子、VIC纯合子和杂合子。
4. 保存结果 切换到Report页面看实验报告。确认无误后，保存分析结果。也可以从File菜单中选择Export，再选择数据类型，输出各种类型的数据。
六. 日常维护
1. 荧光污染的检查与处理 新建一个空的96孔板，菜单Instrument → Calibrate打开ROI Inspector窗口，将Exposure Time调到4096，选定Filter B，点击Snapshot按钮（不要动下面两个按钮，以免ROI设置出错），此时可以看到排列整齐的96孔图像。如果观察到特别明亮的光斑，则表明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的上方可在右侧栏中的Pixel Intensity处读出该孔的荧光信号值，超过500以上的需要清洗。清洗时尽量使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭；如果未能去除，可用去离子水清洗；如污垢顽固，可使用90%乙醇清洗，但要等乙醇*挥发干净后方可盖上热盖，以免有机溶剂损伤热盖上的透镜组。
2. 检测器光源的更换流程 关机冷却约15分钟后，打开仪器顶部盖板，拧松灯泡保护罩的螺钉，取下保护罩，将灯泡拆下，更换新的灯泡并插好连线。注 意：备用的新灯泡必须保存在干燥环境中。